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張鋒團隊帶來第三款CRISPR基因組編輯系統,顯著減少脫靶效應


生物探索本文轉載自」學術經緯「。今天,CRISPR-C基因編輯系統的先驅之一張鋒教授在《自然》子刊《NC》發布一項重要進展,報告了第三個可以...

- 2019年1月23日08時31分
- 科學文摘 / 生物探索

生物探索

本文轉載自」學術經緯「。

今天,CRISPR-Cas基因編輯系統的先驅之一張鋒教授在《自然》子刊《Nature Communications》發布一項重要進展,報告了第三個可以編輯人類細胞基因組的CRISPR-Cas系統:CRISPR-Cas12b。

多功能基因組編輯系統CRISPR-Cas的問世,掀起了一場生物技術革命。在科學研究和醫療研發方面,這套基因編輯工具得到廣泛應用,以此為基礎的基因編輯療法也展開臨床試驗,在治療人類遺傳病方面初現潛力。


這一系統中的「元老」成員就是我們已經熟悉的Cas9。不過Cas9也並非沒有限制,比如切割非靶點序列的脫靶效應就是一個問題。鑒於CRSPR-Cas系統在微生物中廣泛存在,科學家們將Cas蛋白的類型範圍不斷擴大,尋找新秀,例如Cas12a。

▲2017年1月,張鋒教授與NIH兩位科學家在《Cell》發文,詳細歸納了2類CRISPR系統的特點和作用機制(圖片來源:參考資料<2>)

在與Cas9、Cas12a同屬2類CRISPR系統的Cas蛋白中,還有一個富有潛力的成員,就是Cas12b(過去被稱為C2c1)。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小,因此更容易通過病毒載體實現細胞間遞送。

雖然有這樣的優勢,Cas12b的開發卻遇到了一個阻礙。性能最佳的Cas12b來自一種嗜酸耐熱菌(Alicyclobacillus acidoterrestris),但它作為DNA裂解酶的最佳活性需要高達48℃。也就是說,如果放進哺乳動物細胞內,達不到這種Cas12b的溫度要求,酶活性就不能發揮。怎麼「解鎖」這種Cas蛋白呢?

▲Cas9、Cas12a、Cas12b三種核酸酶的基因序列模式圖和蛋白質結構示意圖(圖片來源:參考資料<1>)

為了適用於人類基因組編輯,張鋒教授和同事們首先在Cas12b蛋白家族中尋找喜歡常溫的成員。最終,根據同源序列比對,他們從一種叫作外村尚芽孢桿菌(Bacillus hisashii)的細菌中鑑定出了在人體體溫(37℃時)能保持核酸酶活性的BhCas12b。並且,研究人員還通過調整指導RNA(sgRNA)的結構,讓Cas12b的效率得到大幅提升。


可是,新的問題來了。體外切割實驗發現,原始結構的Cas12b在DNA雙鏈斷裂時會切割非靶標單鏈,並且溫度越低,這種錯誤發生得越多。為了解決這個問題,研究者對Cas12b進行了工程改造。根據蛋白質晶體結構的線索,研究人員通過4個點突變,得到了重新設計的新Cas12b,讓酶的活性位點更容易和DNA靶序列接近。

經過重新設計的Cas12b,基因組編輯的潛能如何呢?在細胞培養實驗中,研究人員針對多個基因的多個靶序列考察了Cas12b的編輯效率。對隨機引入插入缺失的分析結果顯示,新的Cas12b的編輯效率與Cas9和Cas12a相當、甚至更高,足以在人體細胞中作為可編程的基因組編輯工具。

除了有效性,特異性對於一款強大的基因組編輯工具來說也非常重要。這一點,研究團隊也在人類細胞中利用GUIDE-seq技術對全基因組範圍內的脫靶效應進行了檢測。結果表明,相比常用的Cas9,Cas12b導致的錯誤插入缺失都要少得多,脫靶性顯著降低。

▲GUIDE-seq分析顯示,重新設計的Cas12b沒有出現Cas9那樣的脫靶效應(圖片來源:參考資料<1>)

研究團隊相信,在繼Cas9和Cas12a之後,改造的Cas12b將以其分子量小和靶向特異性高的兩大特點,成為又一款在體編輯人類基因組的有力工具。並且,這一顯著提升Cas12b效率的改造工程也為解鎖更多CRISPR工具提供了富有啟發的指導。


End

參考資料:

1)Jonathan Strecker, et al., 2019, Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. Nature Communications. DOI: 10.1038/s41467-018-08224-4

2)Kira Makarova, et al., 2017, SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems. Cell, DOI: 10.1016/j.cell.2016.12.038


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